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微量分光光度計原理及應(yīng)用

   微量分光光度計能夠快速準(zhǔn)確的定量檢測核酸、蛋白質(zhì)等溶液。具有使用方便、消耗樣品少(僅2μl)、不用預(yù)熱、能迅速清理殘留樣品、不需要比色皿或其它樣品定位裝置、樣品不需要稀釋等特點，常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量，目前已成為眾多實驗室的常規(guī)儀器。

  工作原理

  超微量分光光度計進(jìn)行濃度測定的原理是根據(jù)朗伯-比爾（Lamber-Beer）定律，

A＝K·C·L

   式中，A為吸光度；K為吸（消）光系數(shù)；C為溶液的濃度；L為液層厚度。此公式說明：在入射光一定時，溶液的吸光度與溶液的濃度及液層厚度成正比。此式就是光的吸收定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式，又叫朗伯-比爾定律。

  核酸定量

  核酸的定量是超微量分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量測定溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA以及RNA含量。這是由于核酸、核苷酸及其衍生物都具有共軛雙鍵，具有紫外吸收的特性，最大的吸收波長在260nm，吸收波谷在230nm。

  除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。

  蛋白質(zhì)直接定量

  這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。

  比色法蛋白質(zhì)定量

  蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。